CD133功能化肝素/胶原蛋白多层膜改性小口径膨胀体聚四氟乙烯人造血管

2013-10-19 张 鹏 华东理工大学材料科学与工程学院

  小口径膨胀体聚四氟乙烯(ePTFE)人造血管是血管移植手术中最常见的替代品之一,然而术后血栓的形成和血管内腔的再狭窄是导致手术失败的重要因素。采用静电层层自组装的方法构建CD133功能化肝素/胶原蛋白(HEP/COL)多层膜可以抑制血栓的形成,并且为血管的内皮化提供可能;通过扫描电镜、红外谱图跟踪HEP/COL多层膜的组装过程,利用激光共聚焦显微镜来证明抗体的接枝。结果发现,CD133功能化的HEP/COL多层膜成功地覆盖到了ePTFE人造血管表面;接触角从127°减小到106°,表明血管的浸润性得到提高;血小板吸附的实验结果表明,改性后的人造血管表面血小板吸附数量明显减少,具有良好的抗凝血性。

  动脉粥样硬化具有发病率高、死亡率高的特点,是当今医学的一大难题。冠脉搭桥、心外动脉静脉搭桥手术是常见的治疗手段。然而,人体自身血管由于来源少、取材困难,远无法满足需求。膨胀体聚四氟乙烯(ePTFE)人造血管化学性质稳定、质地柔软、具有良好的抗压性,是良好的血管植入材料。与所有植入材料一样,远期血栓的形成也是ePTFE人造血管的一大缺点。尤其当血管口径小于5mm时,由于血流量低,远期血栓发生率接近100%。尽管在表面接枝肝素等生物分子可以提高人造血管的抗凝血性和血液相容性,但这些作用往往不能持久。通过人造血管内壁的内皮化,获得与人体自身血管结构、生理环境相似的材料仍然是防止术后形成远期血栓最理想的途径。

  本文通过层层自组装(Layer-by-layer assembly)的方法将肝素(HEP)、胶原(COL)吸附到ePTFE人造血管表面,并通过戊二醛固定CD133抗体。ePTFE材料表面张力很小,通过聚乙烯亚胺(PEI)分子处理可以有效地提高其表面张力,在血管表面形成稳定的聚阳离子。HEP是一种阴离子多糖,它可以和抗凝血酶III结合成复合物,提高抗凝血酶III对凝血因子的抑制作用,因此作为抗凝剂已经广泛应用于临床中。COL作为细胞外基质的组成成分,大量存在于动物结缔组织中,可以有效地提高血管的细胞相容性。利用层层自组装将HEP/COL分子交替沉积到血管表面。CD133是一种高度保守的抗原,只表达在未分化的内皮祖细胞上,通过接枝CD133抗体,利用抗体与内皮祖细胞表面抗原的特异性结合实现对血液中内皮祖细胞的捕获。因此,改性后的血管表面形成PEI-(HEP/COL)5-CD133涂层,在获得抗凝血性的同时,能够快速内皮化,防止远期血栓的形成及术后血管的再狭窄。

1、实验部分

  1.1、原料

  ePTFE人造血管,口径4mm,美国Gore-tex公司;聚乙烯亚胺(PEI),Mw=10000,溶解于pH为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中,质量浓度为3mg/mL;HEP,上海伯奥生物科技有限公司;COL,上海源叶生物科技有限公司;HEP和COL溶解于pH 为4的醋酸/醋酸钠缓冲液,浓度都为1mg/mL;戊二醛(GA),上海凌峰化学试剂有限公司;CD133抗体,德国美天旎公司,用PBS溶液稀释至60μg/mL。

  1.2、HEP/COL多层膜制备和CD133抗体接枝

  1.2.1、构建HEP/COL多层膜 ePTFE人造血管

  浸泡在乙醇溶液中0.5h,清洗后的血管置于60℃的烘箱中干燥1h。然后将血管放入PEI的PBS缓冲溶液中,静置1.5h后,得到表面带正电荷的血管。将血管放入HEP溶液中,15min后取出,用醋酸缓冲液冲洗表面结合不牢的HEP分子,并用N2吹扫干燥。干燥后的血管立即放入COL溶液中,同样浸泡15min后,用醋酸缓冲液清洗,N2干燥。再重复上述过程4次,得到表面有5层HEP/COL膜的血管,用PBS溶液清洗,N2吹干。

  1.2.2、CD133抗体的接枝

  完成上述改性后,将血管浸入质量分数为0.25%的戊二醛溶液中2h,对HEP/COL进行交联反应,同时得到大量未反应的醛基,取出血管,用PBS溶液清洗3次,用N2吹干。然后将血管置于60μg/mL的CD133溶液中一夜,通过CD133与活性醛基反应,获得(HEP/COL)5-CD133多层膜。带有红色荧光的CD133-PE抗体的接枝反应同上。

  1.3、仪器与测试

  扫描电镜:用日本日立S-4800场发射扫描电子显微镜观察样品表面形貌,样品经过喷金处理20s,放大倍数为1 000倍,扫描电压为10kV;红外光谱检测:用美国Nicolet 5700测定红外光谱,采用衰减全反射,测试范围为400~4 000cm-1;激光共聚焦测试:利用德国Carl Zeiss公司的LSM 510META(Axiovert 200)共聚焦激光扫描显微镜观察血管表面荧光标记的抗体,激光波长670nm;接触角测试:采用SZ10-JC2000A(上海中晨数字技术设备有限公司)静滴接触角测量仪来测定水和试样的接触角:在血管表面选择5个不同的点,测出数值后,求出平均值(在室温下测试,液滴体积2μL)。

  1.4、血小板黏附实验

  将血管片浸泡于新鲜的血小板血浆(取自上海市血液中心)中,作用30min后,用PBS溶液清洗血管片,然后用质量分数为1%的戊二醛固定30min,并用乙醇溶液梯度脱水,静置干燥后用扫描电镜观察表面血小板的吸附情况。

2、结果与讨论

  2.1、扫描电镜观察形貌

  图1为HEP/COL聚电解质生物涂层改性前后ePTFE人造血管的SEM 照片(放大倍数均为1000倍)。从图1(a)可见,未经处理的ePTFE血管由很多节点和纤维组成,呈现出三维的孔隙结构,孔隙长度约为15μm,宽度约为5μm。图1(b~e)分别为(HEP/COL)1、(HEP/COL)2、(HEP/COL)3、(HEP/COL)4、(HEP/COL)5涂层修饰后ePTFE血管的电镜图。由图可见,随着涂层数n 的增加,HEP/COL涂层的面积不断变大,ePTFE血管的三维孔隙结构仍然存在,但孔径尺寸减小。这种表面形貌的逐步改变证明了HEP/COL电解质膜已经成功地组装在人造血管上。

肝素/胶原多层膜改性前后血管表面的SEM 图片

图1 肝素/胶原多层膜改性前后血管表面的SEM 图片

结论

  本文通过层层自组装的方法成功地将HEP、COL分子层层吸附到ePTFE人造血管表面,利用戊二醛接枝CD133抗体,使得CD133抗体均匀地分布在人造血管表面,得到了CD133 功能化的HEP/COL多层膜。改性后的人造血管亲水性增强,血小板吸附实验的结果表明血管表面几乎没有血小板聚集,提高了人造血管的抗凝功能,并且在血管内皮化方面有很好的应用前景。